Гост 18963-73

У нас вы можете скачать гост 18963-73 в fb2, txt, PDF, EPUB, doc, rtf, jar, djvu, lrf!

Целесообразнее воду стерилизовать во флаконе и разливать в пробирки по 9 см 3 непосредственно перед посевом, соблюдая правила стерильности. Приготовляя концентрированную среду, количество всех ингредиентов, кроме воды, увеличивают в 10 раз.

Полужидкую среду применяют при отсутствии сухих сред. Срок хранения — не более 7 сут. Хранить чашки со средой допускается не более двух-трех суток в темноте или. Карболовый раствор генциана фиолетового готовят следующим образом: Раствор Люголя готовят следующим образом: Фуксин Циля готовят следующим образом: Мазок на предметном стекле фиксируют трехкратным проведением через пламя горелки. Хранят во флаконе из темного стекла.

Тщательно и быстро прополаскивают препарат водой, просушивают фильтровальной бумагой, микроскопируют. Раствор готовят непосредственно перед определением. Эндо, снимают петлей или стеклянной палочкой и наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом.

Стерильной палочкой отбирают соответствующие объемы воды и вносят в стерильные чашки, слегка приоткрывая крышку. Для этого в пробирку с 9 см 3 стерильной воды, приготовленной по и.

Воду быстро смешивают с агаром, осторожно наклоняя или вращая чашку по поверхности стола. Для этого чашку кладут вверх дном на черный фон. При посеве 1 см 3 неразведенной пробы учитывают любые количества колоний, но не превышающие Счетную пластинку рекомендуется применять при подсчете количества колоний, когда на обеих чашках отмечен ползучий рост. Обнаружение в воде бактерий группы кишечных палочек следует рассматривать как показатель фекального загрязнения воды, а их количество позволяет судить о степени этого загрязнения.

Количество бактерий группы кишечных палочек определяют методом мембранных фильтров и бродильным методом. При анализе воды, поступающей в водопроводную сеть, и в наиболее характерных ее точках необходимо анализировать объем не менее см 3 , профильтровывая этот объем не менее чем через два фильтра. При анализе воды неизвестного качества следует засевать 3—4 десятикратных объема например, из водопроводной сети можно фильтровать 3; 30; ; см 3 воды; по этапам очистки — 0,1; 1; 10; см 3 воды.

Смену воды и последующее кипячение повторяют 3—5 раз до полного удаления остатков растворителей из фильтров, после чего они готовы к работе. При этом во избежание скручивания мембран необходимо строго соблюдать следующие правила.

На дно сосуда, в котором проводят кипячение химический стакан, эмалированная кастрюля и т. Воду с помещенными в нее мембранами медленно доводят до кипения и кипятят на слабом огне в течение 10—15 мин. Затем воду сливают и заменяют небольшим количеством чтобы покрыть фильтрующие мембраны стерильной дистиллированной воды. Перед посевом воды фильтровальный аппарат стерилизуют фламбированием после обтирания ватным тампоном, смоченным спиртом.

В воронку стакан фильтровального прибора при соблюдении правил стерильности наливают необходимый объем воды и создают вакуум в приемном сосуде. Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, даты посева и номера пробы.

После окончания фильтрования оба фильтра переносят на среду Эндо. Анализ на этом этапе заканчивают через 18—24 ч. Анализ на этом заканчивают через 18—24 ч. Анализ питьевой воды может быть завершен на этом этапе, если нет других колоний, не обладающих оксидазной активностью. Анализ воды по этапам очистки заканчивают через 18—24 ч подсчетом этих колоний для вычисления колииндекса.

Анализ заканчивают через 24—28 ч. При наличии только кислоты пробирки оставляют в термостате для окончательного учета через 24 ч.

При отсутствии газообразования через 24 ч получают окончательный отрицательный результат, при наличии газообразования — положительный результат. Результат выражают в виде колииндекса, т.

Колииндекс высчитывают следующим образом: Пример L При посеве см 3 воды не выросло ни одной колонии. При наличии бактерий группы кишечных палочек вычисляют колииндекс, учитывая весь объем анализируемой воды. В см 3 — сплошной рост, в 10 см 3 — 12 бактерий группы кишечных палочек; колииндекс равен 12 Если на всех фильтрах получен более густой рост и анализ невозможно повторить, то допускается подсчет колоний на фильтре с наименьшим разведением, но с записью в протоколе исследования и в журнале регистрации.

Отсутствие помутнения и образования кислоты и газа во флаконах. Посевной материал следует брать с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. Анализ во всех этих случаях заканчивают через 40—42 ч. Приготовление реактива для определения оксидазной активности бактерий. Раствор готовят непосредственно перед определением. Оксидазный тест предназначается для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadaceae и других водных сапрофитных бактерий, которые обладают активным ферментом оксидазой и окисляют фенилендиаминовые соединения до индофенола ярко-синего цвета.

Постановка оксидазного теста при работе методом мембранных фильтров. Мембранный фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги несколько большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченный реактивом. Через 2 - 4 мин определяют результат. Все посиневшие колонии или с синим ободком не относятся к семейству Enterobacteriaceae, их учитывают.

Учитывая бактерицидность реактива для определения оксидазной активности, мембранный фильтр сразу же после четкого проявления реакции переносят обратно на среду Эндо и немедленно не позднее чем через 5 мин пересеивают оксидазоотрицательные колонии в полужидкую среду с глюкозой.

Постановка оксидазного теста при работе бродильным методом. По 2 - 3 изолированные колонии каждого типа, выросшие на секторах среды Эндо, снимают петлей или стеклянной палочкой и наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом.

В месте нанесения бактериальной массы бумага не изменяет цвета, если оксидазный тест отрицательный, и синеет в течение 1 мин, если бактерии имеют активную оксидазу. Исследование изолированных колоний является обязательным, иначе можно необоснованно отбросить кишечную палочку при ложном посинении за счет примеси оксидазоположительных бактерий.

Если оксидазный тест со среды Эндо проявляется недостаточно четко из-за того, что мешают ингибиторы это относится в основном к темно-красным колониям , то для получения правильного результата такие колонии можно пересеять на сектора или на скошенный питательный агар и после подращивания повторить оксидазный тест.

Определение общего количества бактерий в воде. Стерильные чашки Петри раскладывают на столе и подписывают на крышках номер пробы, дату посева и объем посеянной воды.

Из каждой пробы должен быть сделан посев не менее двух различных объемов, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до колоний. При исследовании водопроводной воды засевают в каждую из двух чашек по 1 см 3.

С флаконов с пробой воды снимают бумажные колпачки, вынимают пробки, горлышки фламбируют, после чего воду тщательно перемешивают осторожным продуванием воздуха через стерильную пипетку. Стерильной палочкой отбирают соответствующие объемы воды и вносят в стерильные чашки, слегка приоткрывая крышку.

Для посева 0,1 см 3 и меньших объемов воды используют разведения анализируемой воды. Для этого в пробирку с 9 см 3 стерильной воды, приготовленной по п. При этом пипетка должна быть опущена ниже поверхности воды не более чем на 3 мм, чтобы избежать смывания бактерий с наружной стороны. Другой стерильной пипеткой продуванием воздуха тщательно перемешивают содержимое пробирки, отбирают из нее 1 см 3 и переносят в чашку, что будет соответствовать посеву 0,1 см 3 анализируемой воды.

При необходимости посева меньших объемов воды этой же пипеткой переносят 1 см 3 содержимого первой пробирки в следующую с 9 см 3 стерильной воды. Посев 1 см 3 из второй пробирки будет соответствовать посеву 0,01 см 3 анализируемой воды и т.

После внесения воды в чашки Петри ее заливают 10 - 12 см 3 остуженного питательного агара при фламбировании краев пробирки или бутылки, где он содержится. Воду быстро смешивают с агаром, осторожно наклоняя или вращая чашку по поверхности стола. Необходимо избегать образования пузырьков воздуха, незалитых частей дна чашки, попадания среды на края и крышку чашки.

После этого чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания среды. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном не более чем по 3 - 4 чашки вместе. Колонии, выросшие как на поверхности, так и в глубине агара, подсчитывают с помощью лупы с увеличением в 2 - 5 раз или прибора для счета колоний.

Для этого чашку кладут вверх дном на черный фон. Для большей точности счета каждую подсчитанную колонию отмечают со стороны дна тушью или чернилами для стекла. Оценивают только те разведения, при посеве которых на чашке выросло от 30 до колоний. При посеве 1 см 3 неразведенной пробы учитывают любые количества колоний, но не превышающие Если в чашке с наиболее высоким разведением выросло свыше колоний и анализ нельзя повторить, то допускается подсчитывать колонии с помощью пластинки с сеткой и лупы при сильном боковом освещении.

Подсчитывают не менее 20 квадратов площадью 1 см 2 каждый в разных местах чашки, затем выводят среднеарифметическое число колоний на 1 см 2 , значение которого умножают на площадь чашки в см 2 , вычисленную по формуле.

Результат подсчета колоний в каждой чашке выражают в количестве бактерий на 1 см 3 анализируемой воды с учетом посеянного объема. За окончательное количество бактерий принимают среднеарифметическое результатов подсчета на двух параллельных чашках или разных разведений.

Результаты округляют следующим образом: Количество колоний учитывают, ориентируясь на одну чашку, в случаях: Счетную пластинку рекомендуется применять при подсчете количества колоний, когда на обеих чашках отмечен ползучий рост. При этом просчитывают квадраты на свободных от сплошного роста местах чашки. Окончательный результат вносят в протокол анализа или в журнал регистрации, где должны быть приведены сведения из сопроводительного документа к пробе воды.

Кроме того, отмечают особые обстоятельства анализа превышение срока хранения пробы, изменение температуры и времени инкубации посевов, применение заменителей при приготовлении питательных сред и прочие вынужденные отклонения. Определение количества бактерий группы кишечных палочек.

Обнаружение в воде бактерий группы кишечных палочек следует рассматривать как показатель фекального загрязнения воды, а их количество позволяет судить о степени этого загрязнения. Количество бактерий группы кишечных палочек определяют методом мембранных фильтров и бродильным методом. При анализе воды, поступающей в водопроводную сеть, и в наиболее характерных ее точках необходимо анализировать объем не менее см 3 , профильтровывая этот объем не менее чем через два фильтра.

На этапах очистки анализируют не менее двух десятикратных объемов воды, выбранных в зависимости от ее качества так, чтобы на одном из фильтров вырастало не более 30 колоний бактерий группы кишечных палочек. При этом необходимо ориентироваться на результаты предыдущих анализов воды в этих же пунктах например для воды после первичного хлорирования могут быть выбраны объемы 10 и см 3 ; для воды необеззараженной - 0,1; 1 и 10 см 3. При анализе воды неизвестного качества следует засевать 3 - 4 десятикратных объема например из водопроводной сети можно фильтровать 3; 30; ; см 3 воды; по этапам очистки - 0,1; 1; 10; см 3 воды.

Смену воды и последующее кипячение повторяют 3 - 5 раз до полного удаления остатков растворителей из фильтров, после чего они готовы к работе. Подготовленные фильтры сохраняют сухими или в широкогорлой банке с дистиллированной водой.

Перед употреблением фильтры стерилизуют кипячением в дистиллированной воде. При этом во избежание скручивания мембран необходимо строго соблюдать следующие правила. На дно сосуда, в котором производят кипячение химический стакан, эмалированная кастрюля и т. Дистиллированную воду заливают в этот сосуд в небольшом объеме, ограничивающем свободное вращение в ней фильтрующих мембран, но достаточном для того, чтобы предназначенные для стерилизации фильтрующие мембраны были покрыты водой.

Воду с помещенными в нее мембранами медленно доводят до кипения и кипятят на слабом огне в течение 10 - 15 мин. Затем воду сливают и заменяют небольшим количеством чтобы покрыть фильтрующие мембраны стерильной дистиллированной воды. После этого фильтрующие мембраны готовы к употреблению. При необходимости, может производиться повторное кипячение фильтрующих мембран. Подготовка фильтровального аппарата к анализу. Перед посевом воды фильтровальный аппарат стерилизуют фламбированием после обтирания ватным тампоном, смоченным спиртом.

После охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата столик кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его верхней частью прибора стаканом, воронкой и закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора.

В воронку стакан фильтровального прибора при соблюдении правил стерильности наливают необходимый объем воды и создают вакуум в приемном сосуде. Фильтруют сначала меньшие, а затем большие объемы воды через один фильтровальный аппарат, меняя каждый раз фильтры.

При фильтровании небольших объемов воды 1 см 3 в воронку сначала наливают 10 см 3 стерильной воды, а затем вносят анализируемую воду. После окончания фильтрования воронку снимают, фильтр осторожно приподнимают за край фламбированным пинцетом при сохранении вакуума для удаления излишка влаги на нижней стороне фильтра, а затем переносят его, не переворачивая, на среду Эндо, разлитую в чашку Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром.

Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх. Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, даты посева и номера пробы. На одну чашку можно поместить 3 - 4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались. После окончания фильтрования оба фильтра переносят на среду Эндо. При выведении результатов анализа учитывают рост бактерий на обоих фильтрах. После окончания фильтрования предварительную и основную мембраны переносят на среду Эндо.

При определении результатов анализа учитывают рост бактерий на обеих фильтрующих мембранах. При отсутствии каких-либо колоний на фильтрах или при наличии только пленчатых, губчатых, с неровной поверхностью и краями, плесневых и других нехарактерных для кишечных палочек колоний дают отрицательный результат на присутствие бактерий группы кишечных палочек в анализируемом объеме воды. Анализ на этом этапе заканчивают через 18 - 24 ч. При наличии на фильтрах колоний, характерных для кишечных палочек темно-красных с металлическим блеском и без него, розовых, прозрачных , из нескольких колоний каждого типа готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Отсутствие в мазках грамотрицательных неспороносных палочек дает отрицательный ответ. Анализ на этом заканчивают через 18 - 24 ч.

При наличии в мазках грамотрицательных, коротких, полиморфных, не образующих спор палочек возможны удлиненные нитевидные формы, а также крупные палочки, полярно окрашенные выполняют оксидазный тест п.

Наличие активной оксидазы у всех колоний, кроме перечисленных в п. Отсутствие оксидазы у темно-красных с металлическим блеском и без него лактозоположительных колоний позволяет отнести их к бактериям группы кишечных палочек и немедленно дать положительный ответ. Анализ питьевой воды может быть завершен на этом этапе, если нет других колоний, не обладающих оксидазной активностью.

Анализ воды по этапам очистки заканчивают через 18 - 24 ч подсчетом этих колоний для вычисления колииндекса. При наличии на фильтрах розовых и бесцветных колоний с отрицательной оксидазной активностью их подсчитывают и подтверждают принадлежность к бактериям группы кишечных палочек посевом 2 - 3 изолированных колоний каждого типа в полужидкую среду с глюкозой. При образовании кислоты и газа результат анализа считают положительным. При отсутствии кислоты и газа получают отрицательный результат.

Анализ заканчивают через 24 - 28 ч. При наличии только кислоты пробирки оставляют в термостате для окончательного учета через 24 ч. При отсутствии газообразования через 24 ч получают окончательный отрицательный результат, при наличии газообразования - положительный результат. Результат выражают в виде колииндекса, то есть количества бактерий группы кишечных палочек в 1 дм 3 воды. Колииндекс высчитывают следующим образом: При отсутствии на фильтрах бактерий группы кишечных палочек колииндекс будет меньше той величины, которая была бы определена в случае обнаружения в анализируемом объеме одной клетки кишечной палочки.

При посеве см 3 воды не выросло ни одной колонии. При наличии бактерий группы кишечных палочек вычисляют колииндекс, учитывая весь объем анализируемой воды.

Если на одном из фильтров сплошной рост бактерий и подсчет их невозможен, тогда в расчет принимают тот объем воды, при фильтровании которого на фильтре выросли изолированные колонии. При подсчете колииндекса в пробах воды необеззараженной, с большим фекальным загрязнением, когда для анализа профильтровывают объем воды менее 10 см 3 или ее разведения, то для учета выбирают тот фильтр, на котором выросло не менее 10 и не более 30 изолированных колоний кишечных палочек.

Количество колоний на нем, относимых к бактериям группы кишечных палочек, пересчитывают на 1 дм 3 с учетом только того объема воды, который профильтрован через этот фильтр. Если на всех фильтрах получен более густой рост и анализ невозможно повторить, то допускается подсчет колоний на фильтре с наименьшим разведением, но с записью в протоколе исследования и в журнале регистрации. Результат в виде колииндекса вносят в журнал регистрации и в протокол анализа, где помечают особые обстоятельства, имевшие место при анализе воды отклонения в температуре инкубации, составе используемых сред, особенно добавки в среду Эндо и т.

Посев ,0 и 10,0 см 3 воды производят во флаконы и пробирки соответственно с 10,0 и 1,0 см 3 концентрированной среды; посев 1,0 и 0,1 см 3 воды - в пробирки с 10,0 см 3 среды нормальной концентрации.

Отсутствие помутнения и образования кислоты и газа во флаконах и пробирках позволяет получить отрицательный результат на наличие бактерий группы кишечных палочек в исследованном объеме воды и закончить исследование через 24 ч. Из каждого флакона, где отмечены помутнение, кислота и газ, а также помутнение и кислота при использовании глюкозопептонной среды или помутнение при использовании лактозопептонной среды, высевают петлей штрихами на поверхность среды Эндо, разделенной на 3 - 4 сектора.

Посевной материал следует брать с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. При получении сплошного роста необходимо рассеивать посевной материал на чашку со средой Эндо для выделения изолированных колоний. При отсутствии роста колоний на секторах среды Эндо, а также при наличии пленчатых, губчатых, с неровными краями и поверхностью, плесневых и других нехарактерных для кишечных палочек колоний получают отрицательный результат. Если при высеве из флаконов и пробирок, где отмечены помутнение, кислота и газ, на секторах среды Эндо выросли темно-красные с металлическим блеском и без него лактозоположительные колонии, то их принадлежность к бактериям группы кишечных палочек подтверждают микроскопированием и постановкой оксидазного теста по п.

Наличие грамотрицательных палочек в мазках и отрицательный оксидазный тест позволяют немедленно дать положительный ответ о наличии бактерий группы кишечных палочек в анализируемом объеме воды. Анализ воды по этапам очистки заканчивают учетом результатов по наличию или отсутствию на подтверждающей среде Эндо темно-красных колоний грамотрицательных палочек, не обладающих оксидазной активностью.

При анализе питьевой воды учитывают и те секторы, где выросли только розовые и бесцветные колонии, или где темно-красные колонии оказались оксидазоположительными.

В этом случае из двух - трех разного типа колоний каждого сектора приготовляют мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют, а также проверяют оксидазную активность по п. При наличии только грамоположительных спорообразующих бактерий получают отрицательный результат. Наличие активной оксидазы у всех бактерий, высеянных из флаконов или пробирок, кроме перечисленных в п.